Assassin’s Creed: Brotherhood — первая игра серии, в которой реализован мультиплеер. Как было показано во время побега из штаба организации «Абстерго» (англ. «Abstergo») в начале игры Assassin's Creed II, тамплиеры построили специальный объект, содержащий в себе несколько десятков устройств «Анимус». Этот объект служит полигоном для подготовки новобранцев ордена с целью ликвидации ордена ассасинов. Тамплиеры намерены использовать технику и приспособления своих противников, используя воспоминания самых квалифицированных ассасинов.

В мультиплеере доступны две фракции: организация тамплиеров «Абстерго» и орден ассасинов. В мультиплеере будут представлены несколько игровых персонажей-классов (подтверждены — Куртизанка (англ. Courtesan); Охотник (англ. Hunter); Арлекин (англ. Harlequin); Парикмахер (англ. Barber); Палач (англ. Executioner); Дворянин (англ. Noble); Священник (англ. Priest); Доктор (англ. Doctor) и Торговец (англ. Merchant); Кузнец; Солдат; у каждого из которых имеется своя особая техника убийства и свой комплекс навыков и оружия. В игре присутствуют несколько различных режимов мультиплеерной игры. На данный момент подтверждён режим «Розыск» (англ. «Wanted»), в котором участвуют от 6 до 8 человек на небольшой карте, где каждый игрок преследует другого. В начале раунда каждый игрок получает определённую замаскированную цель, которую надо уничтожить; при этом, сам игрок так же является чьей-то целью. На каждой карте будут находиться управляемые компьютером NPC, под которых и маскируются игроки, выбирая свой игровой класс.

Мультиплеер игры будет осуществляться через игровые сети Xbox Live, PlayStation Network и Games for Windows — Live.